Mir-Hossein Mousavi telah dilahirkan pada 29 September 1941 di Khameneh, Azarbaijan Timur, Iran. Bapanya Mir-Esma'il Mousavi, seorang pedagang daripada Tabriz. Mousavi menikahi Zahra Rahnavard, seorang canselor Universiti Alzahra dan penasihat politik bekas Presiden Iran Mohammad Khatami. Mousavi adalah abang ipar Pemimpin Agung Iran, Ali Khamenei.[2]

Mousavi belajar di sekolah tinggi di Tehran pada 1958. Di University Kebangsaan Teheran (kini Universiti Shahid Beheshti), Mousavi mengkhusus dalam jurusan seni bina dan lulus dengan BA pada 1969. Pada 1983, Mousavi mengkhusus dalam jurusan senibina Islam tradisional.

Pertengahan 1979 Mousavi pernah dilantik oleh Khomeini ke jawatan Majlis Revolusi Islam.Sebagai editor rasmi Parti Republikan Islam, Jomhouri-e Eslami, Mousavi diserang oleh Abolhassan Banisadr, presiden pertama Republik Islam. Mousavi pernah dilantik sebagai menteri luar.